《Analytical Chemistry》：原位丙酮酸激酶 M2 同种型 (PKM2) 标记的荧光探针

近期，大连理工大学化学生物学课题组在肿瘤标志物的荧光可视化方向取得新进展，相关成果以“Discovery of a fluorogenic probe for in situ pyruvate kinase M2 iso-form (PKM2) labeling through chemoselective S_NAr with a binding site lysine residue”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（Anal.Chem. 2021, 93, 9669-9676）。第一作者大连理工大学特评副教授王紫千，通讯作者为张志超教授。

基于反应的turn-on型荧光探针是利用探针与分析物发生化学反应前后荧光发生变化，实现对分析物特异性识别的一类荧光探针。该技术因具有操作简单，高灵敏性、高选择性、低成本、无创、原位和实时检测等优点，被广泛地应用于生物、医学、化学生物学等领域。对于蛋白质类生物标志物，基于反应的turn-on型荧光探针通过与靶蛋白表面的亲核性氨基酸残基（半胱氨酸Cys、赖氨酸Lys、组氨酸His和酪氨酸Tyr等）发生S_NAr取代反应实现对靶蛋白的共价标记，并伴随着荧光变化。该课题组在2019年曾报道了一个通过S_NAr反应标记Cys和Lys残基的turn-on荧光探针，6-苯巯基-1-氧-1H-非那烯-2,3-二腈（AT-OPD，Analyst2019, 144, 3260-3266）。但是这类探针因其具有较高的反应活性，容易受到细胞内大量存在的谷胱甘肽（GSH）等生物硫醇的干扰，无法实现对靶蛋白的特异性标记。

图1. AT-OPC1荧光标记Lys反应机理图

       在本研究中，王紫千副教授通过在AT-OPD衍生物2位引入弱吸电子能力的酯基和硝基苯等基团，降低AT-OPD衍生物6位与亲核性氨基酸残基的反应活性，通过对细胞的蛋白质组的荧光标记，获得了一个特异性识别丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）的基于反应的turn-on型荧光探针AT-OPC1。丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）在多种人类癌细胞中高表达，促进有氧糖酵解和合成代谢，是多种肿瘤的潜在生物标志物。因此，利用荧光探针可视化研究早期癌症发生和发展过程中细胞内PKM2水平的动态变化，有利于癌症的早期准确诊断。

利用基于活性的分子探针技术结合蛋白质酶切与LC-MS/MS实验，证明AT-OPC1在细胞原位和蛋白质组水平上特异性非共价结合PKM2蛋白之后，与赖氨酸残基Lys305发生亲核反应并实现了荧光turn-on响应。

图2. 加入AT-OPC1后，利用凝胶荧光成像和细胞荧光成像反映肿瘤细胞和正常细胞PKM2蛋白的水平差异。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00208